Иммуносорбентный анализ с ферментной меткой (твердофазный иммуноферментный анализ): методы и интерпретация

Иммунологические анализы — это процедуры, в которых используется взаимодействие между антителом и антигеном с целью качественного или количественного обнаружения определенных веществ. Иммуносорбентный анализ с ферментной меткой (твердофазный иммуноферментный анализ, тест ELISA) — это разновидность иммунологического анализа, при котором измеряемый сигнал вырабатывается ферментом и его реакцией с сигнальным веществом (субстратом). Ферментный иммунологический анализ в большинстве случаев используется поочередно с иммуносорбентным анализом с ферментной меткой (таблица 1). Иммуносорбентные анализы с ферментной меткой часто используются для обнаружения антигенов, антител или комплексов антител и антигенов, ассоциируемых с инфекционными агентами. Однако существует возможность разработки методики иммуносорбентного анализа с ферментной меткой с целью обнаружения любой субстанции, против которой можно выработать специфическое антитело.

В зависимости от конкретного анализируемого вещества и типа иммуносорбентного анализа с ферментной меткой антиген или антитело бывают связанными с твердой фазой. Как правило, твердой фазой являются пластические ячейки пластины (панели) микротитратора иммуносорбентного анализа с ферментной меткой (как правило, полистирол) или мембрана (обычно нитроцеллюлоза). Материал, который может содержать анализируемое вещество, добавляют к твердой фазе для того, чтобы могла произойти первичная реакция между антигеном и антителом. После этого добавляют систему обнаружения с ферментной меткой (конъюгату) для выявления первичной реакции антигена и антитела. Если конъюгата оказывается связанной, это свидетельствует о том, что произошла первичная реакция антигена и антитела. При добавлении сигнального вещества изменяется цвет (рис. 1).

В системах обнаружения иммуносорбентного анализа с ферментной меткой (твердофазного иммуноферментного анализа) могут использоваться моноклональные или поликлональные антитела, которые бывают гетерогенными (различные виды) или гомогенными. В ходе анализа используются множественные ферменты и субстраты. Существуют различные потенциальные производные иммуносорбентного анализа с ферментной меткой, включая прямой, косвенный анализ, анализ по типу «сэндвич» (рис. 2), а также конкурентный анализ (рис. 3).
Результаты иммуносорбентного анализа с ферментной меткой можно оценивать визуально путем сравнения изменения цвета анализируемых образцов с цветом контрольных образцов или путем определения степени абсорбции при помощи спектрофотометра. При использовании спектрофотометра результаты можно определить путем неоднократного (кинетического) измерения параметров реакции или измерения в определенный период времени (конечная точка).

Результаты могут быть выражены в титрах или других единицах, например процент иммуносорбентного анлиза с ферментной меткой (ELISA), активность фермента, активность антитела или удельная концентр ция измеряемой субстанции. Титр — это обратная в личина степени наиболее полного растворения образца, при котором наблюдается предопределенная положительная реакция в ходе иммунологического анализа, с ферментной меткой. Как правило, нельзя напрямую сравнивать выраженные в титрах результаты различных анализов или анализов, выполненных разными лабораториями.

Невозможно делать общие выводы относительно чув ствительности, специфичности, предсказанных значений и точности иммуносорбентных анализов с ферментной меткой по сравнению с другими видами анализов или даже другими видами этого же анализа, при которых проводится обнаружение одной и той же субстанции. Использование различных антител, буферных генов (буферов) твердых материалов, субстратов и инкубационных периодов резко изменяет результаты иммуносорбентного анализа с ферментной меткой. Результаты каждого отдел нога анализа необходимо подтверждать. При появление новых методов иммуносорбентного анализа с ферментной меткой или других видов иммунологического анализа специалисту-ветеринару необходимо их критически оценить и лишь затем использовать на практике.

Таблица 1. Определение понятий, используемых при иммуносорбентных анализах с ферментной меткой
Сродство Внутреннее притяжение (связь) одной субстанции к другой (антитела к антигену)
Анализируемое вещество Измеряемый антиген или антитело
Антиглобулин Антитело, которое обнаруживает другое антитело
Место соединения антител Место изменяемой области антител, которое соединяется с эпитопом антигена
Антигены Субстанции, специфически признаваемые иммунной системой
(в иммунологических анализах — антитело)
Авидитет Свойство молекулярной диссоциации, задерживающее диссоциацию, обычно сочетание сродства
и взаимодействия реагентов с твердой фазой
Блокирование Белок или детергент, используемые для блокирования неспецифических реакций между реагентами
иммуносорбентного анализа с ферментной меткой или между реагентами и твердой фазой
Захватывающее антитело Иммобилизованное антитело, используемое для захвата в образце антигена, представляющего интерес
Конкурентный иммуносорбентный анализ с ферментной меткой Иммуносорбентный анализ с ферментной меткой, при котором обнаружение анализируемого вещества основано на его способности количественно замедлять связывание определенного количества стандартного анализируемого вещества и ограниченного количества антител
Конъюгата Ковалентный комплекс двух биомолекул. При иммуносорбентном анализе с ферментной меткой
конъюгатой является антитело или антиген, связанные с ферментом
Прямой иммуносорбентный анализ с ферментной меткой Иммуносорбентный анализ с ферментной меткой, при котором первичная реакция антигена и антитела измеряется непосредственно, поскольку один из реагентов непосредственно маркирован ферментом
Эпитоп Часть биомолекулы (антиген), специфически признаваемая местом соединения антитела.
Синонимом является антигенная детерминанта
Иммунофильтр Иммунологический анализ, при котором иммунохимическая реакция между антигеном и антителом
происходит на фильтрующей мембране
Косвенный иммуносорбентный анализ с ферментной меткой Иммуносорбентный анализ с ферментной меткой, при котором обнаружение первичной реакции антигена и антитела производится при помощи помеченного ферментом антиглобулина
Нитроцеллюлоза Наиболее широко распространенный тип мембраны, используемой для иммунофильтра
Неспецифическая реакция связывания комплемента Связывание конъюгаты по неиммунному/неспецифическому типу, которое может привести к высокому уровню сигнала и ложным позитивным реакциям
Точность Согласование повторных изменений в рамках анализа или между анализами
характеризует воспроизводимость
Сигнальная субстанция Биомолекула, вырабатывающая сигнал, свидетельствующий о ее присутствии. При иммуносорбентнои
анализе с ферментной меткой сигнальной субстанцией часто является субстрат
Иммуносорбентный анализ с ферментной меткой по типу «сэндвич»  Вид иммуносорбентного анализа с ферментной меткой, при котором захват анализируемого реагента производится одним антителом, а обнаружение — другим антителом, связанным с ферментами
Титр Обратная величина степени наиболее полного растворения образца, при котором наблюдается
предопределенная положительная реакция в ходе иммунологического анализа
Вестерн-блот Метод, при помощи которого производится разделение молекул методом электрофореза на геле, их
перемещение к фильтрующей мембране, а затем обнаружение антителами или специальными красителями

 При оценке самого иммуносорбентного анализа с ферментной меткой понятие аналитической чувствиявности определяет минимальное количество субстанции, которую можно обнаружить и точно измерить. Аналитическая специфичность показывает, вступает ли наруженная субстанция в перекрестную реакцию другими субстанциями. Диагностическая чувствительность — это соотношение положительных результатов исследований известных зараженных животных. Диагностическая специфичность — соотношение отрицательных результатов исследования известных незараженных. Предсказанное значение положительного исследования — это вероятность того, что животное с положительной реакцией заболеет. Предсказанное значение отрицательного исследования — это вероятность того, что животное с отрицательной реакцией является нормальным. Чем ниже распространенность заболевания, тем ниже предсказанное значение положительного исследования (Jacobson, 1991). Эта концепция имеет большое значение для клиницистов, поскольку количество случаев ложной положительной реакции возрастает при иседовании популяций, в незначительной степени подвергающихся опасности заражения изучаемым заболеванием. Распространенность заболевания оказывает незначительное влияние на отрицательные предсказанные значения.

В следующем разделе приводится краткое описание обнаружения антител и антигенов, основанных на иммуносорбентном анализе с ферментной меткой и применяемых ветеринарными врачами для лечения домашних животных

Обнаружение антитела

 Cыворотка

Иммуносорбентные анализы с ферментной LISA) обычно проводят с целью обнаружения антител в сыворотке Эти методы анализа могут быть изменены лью обнаружения специфических классов антител. Методы фиксации комплементов, ингибирования гемаглютинации, нейтрализации сыворотки и агглютинации к правило, позволяют обнаружить все классы антител в образцах сыворотки. При оценке результатов серологической реакции (сывороточной пробы) важно знать, является ли анализ специфическим для одного или нескольких иммуноглобулинов. Под воздействием чужих антигенов иммунная система вырабатывает сывороточные антитела (гуморальная и иммунная реакции). Обычно производится анализ следующих специфических антител:

  1. иммуноглобулин М (IgM)
  2. иммуноглобулин G (IgG)
  3. иммуноглобулин A (IgA)
  4. иммуноглобулин Е (IgE)

У собак и кошек, как правило, сначала вырабатывается IgM, а затем происходит быстрое смещение класса антител в сторону IgG. Сывороточные реакции IgA часто являются отражением реакции IgG (рис. 4). Положительные титры IgM часто являются подтверждением недавней или активной инфекции, а положительные титры IgG зачастую указывают на более хроническое воздействие специфического антигена

Животные отличаются друг от друга по своей гумо ральной реакции на специфические антигены. Некоторые животные обладают высокой иммунокомпетентностью и вырабатывают большое количество специфического антитела, а у других такой реакции не наблюдается, Таким образом, значение титра антитела не позволяет окончательно судить о том, как давно происходила антигенная стимуляция. В особенности это касается антител класса IgG и реагентов, приводящих к хроническим инфекциям. Например, у многих здоровых кошек, в порядке эксперимента инокулированных Toxoplasma gondii, через 6 лет после последней инокуляции наблюдались титры антител IgG, превышающие 10000

Увеличение титров антител позволяет говорить о том, что антигенная стимуляция происходила недавно Однако промежуток времени между первыми положительными результатами и максимальными значениями титров антитела может быть очень коротким. Например, у кошек, инокулированных Bartonella henselae, антитела могут быть обнаружены на 14-й день после инокуляции а максимальные титры обычно наблюдаются на 21-й день после инокуляции. Если необходимо подтвердить увеличение титров антител посредством иммуносорбентного анализа с ферментной меткой, лучше использовать один и тот же метод анализа, одну и ту же лабораторию, а также анализировать в ходе одного и того же исследования образцы сыворотки, взятые в период обострения и в период выздоровления. Это позволит свести до минимума возможные отклонения.

Некоторые инфекционные заболевания могут вызывать клинические симптомы болезни до появления положительного титра антител, в особенности если проводятся измерения класса антител IgG, например, Ehrlichia canis, вирус иммунодефицита кошек и Rickettsia rickettsii. При обнаружении отрицательных реультатов серологического анализа у животных с обострением заболевания, которое может быть связано с испытуемыми реагентами, серологический анализ следует повторить через две-три недели.

Правильный выбор времени для анализа антител имеет очень большое значение при обследовании котят из-за возможности обнаружения антител, передаваемых от матери вместе с молозивом. В большинстве случаев при положительных результатах сывороточной пробы на антитела нельзя считать, что антитела вырабатываются организмом котенка, пока он не достигнет возраста 8-12 недель. Многие из инфицирующих факторов, встречающихся в практике лечения домашних животных, приводят к заражению большого процента популяции и выработке антител в сыворотке, однако индуцируют болезнь лишь у незначительной части инфицированной группы. Примером являются короновирусы, вирус чумы собак, вирус герпеса 1, Toxoplasma gondii, Borrelia burgdorferi и Rickkettsia rickettsii. Существуют методы анализа, обладающие достаточной аналитической чувствительностью и специфичностью для обнаружения сывороточных антител против этих патогенных факторов. Однако предсказанное значение положительной реакции на болезнь крайне незначительно, поскольку антитела обычно обнаруживают у здоровых животных. Таким образом, диагностическая значимость некоторых сывороточных проб ограничена из-за антител, индуцированных вакцинацией. Примерами являются коронавирусы у кошек, Borrelia burgdorferi, герпесвирус кошек 1, калицивирус и вирус чумы собак. Поскольку сывороточная проба далеко не всегда означает клиническую стадию многих инфекционных заболеваний, клиницистам не следует торопиться ставить такие диагнозы лишь на основе результатов серологической реакции. Положительный диагноз должен основываться на комбинации данных серологического исследования, типичных данных из истории болезни, характерных клинических и лабораторных данных, подтверждающих болезнь, исключении возможности других заболеваний сходной этиологии, изучении особенностей организма и (или) реакции на курс терапии.

 Жидкости организма
Данные о наличии специфически реагирующих на различные факторы антител во внутриглазной жидкости, жидкой части стекловидного тела или спинномозговой жидкости могут быть использованы для подтверждения диагноза инфекции этих тканей. Иммуносорбентный анализ с ферментной меткой является надежным методом для исследований такого типа, поскольку он позволяет легко определить количественные показатели. Результаты исследования антител жидкой части стекловидного тела или спинномозговой жидкости трудно правильно оценить при наличии антител в сыворотке на фоне воспалительного заболевания, поскольку сывороточные антитела попадают во внутриглазную и спинномозговую жидкости в процессе воспаления. Ниже приводится формула для определения количества антител, вырабатываемых локально глазом или центральной нервной системой.


Если это соотношение превышает 1, можно предположить, что антитело внутриглазной или спинномозговой жидкости вырабатывалось локально, что соответствует инфекционной болезни глаза или центральной нервной системы.

Обнаружение антигенов

Метод иммуносорбентного анализа с ферментной меткой можно использовать для измерения любого вещества, против которого могут вырабатываться антитела. Примерами являются антигены инфекционных факторов, антигены, ассоциируемые с клетками (включая опухоли), рецепторы, гормоны и лекарственные средства. Как правило, любую субстанцию, которую можно измерить методом радиоиммуноанализа, можно также измерить при помощи иммуносорбентного анализа с ферментной меткой.

При помощи иммуносорбентного анализа с ферментной меткой в общей воде организма или фекалиях можно обнаружить антигены некоторых инфекционных факторов. В настоящее время можно приобрести наборы для иммуносорбентного анализа с ферментной меткой с целью обнаружения в сыворотке или плазме антигенов к Dirofilaria immitis и вирусу лейкемии кошек. Разработаны также методы иммуносорбентного анализа с ферментной меткой для исследования антигена вируса лейкемии кошек в слюнной и слезной жидкостях. Как правило, данные методы анализа имеют хорошую чувствительность и специфичность. Анализы на антиген Dirofilaria immitis могут дать ложноотрицательные результаты у некоторых животных при незначительном количестве патогенных микроорганизмов или инфекционных заболеваниях, типичных только для одного (мужского) пола. Это наиболее характерно для кошек. Анализ на антиген вируса лейкемии кошек может дать ложноотрицательные результаты при обследовании кошек с локализованным или изолированным вирусным инфекционным заболеванием (латентным). Результаты анализа сыворотки или плазмы на антиген вируса лейкемии кошек могут также быть кратковременно положительными для кошек. Таким образом, положительные результаты иммуносорбентного анализа с ферментной меткой, проводимого при исследовании здоровых кошек, необходимо подтверждать повторным анализом с использованием этого же метода через 3-4 недели или при помощи анализа антител методом иммунофлюоресценции. Поскольку у здоровых животных без клинических отклонений может быть выявлена положительная реакция на антигены в результате иммуносорбентного анализа с ферментной меткой, положительным предсказанным значением заболевания не может быть 100%, в особенности при низкой распространенности заболевания. Положительные результаты анализа на антиген вируса лейкемии кошек также не свидетельствуют об иммунодефиците.

Существуют методы иммуносорбентного анализа с ферментной меткой для обнаружения парвовируса, Cryptosporidium parvum и Giardia spp. в фекалиях. Метод анализа на парвовирус позволяет обнаружить антигены парвовируса как у собак, так и у кошек. В настоящее время известны минимальные результаты чувствительности и специфичности для анализов на С. parvum и Giardia spp. при исследовании экскрементов домашних животных. При использовании этих методов анализа их результаты следует оценивать вместе с результатами исследования фекалий на ооцисты (Cryptosporidium) или цисты {Giardia).

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *