Молекулярная биология инфекционных заболеваний

Микроорганизмы невидимы невооруженным глазом, однако за последние 100 лет мы научились наблюдать их самыми различными способами. Сначала их рассматривали под обычным, а затем и под электронным микроскопом. Следующим этапом стало помещение меченых атомов на антитела, выработанные для противодействия протеинам микроорганизмов. Относительно недавно мы стали использовать бактериальную плазмидную ДНК в качестве генетического отпечатка следов распространения антибиотичной сопротивляемости среди грамотрицательных бацилл. С открытием полимеразной цепной реакции (ПЦР) мы получили возможность не только более тщательно исследовать генетические отпечатки микроорганизмов, но даже размножать их ДНК, так что теперь их можно увидеть невооруженным глазом как полоски на геле! Феноменальную способность ПЦР размножать ДНК можно сравнить со способностью найти иголки в стоге сена, а затем и создать целый стог этих иголок.

Существует четыре способа применения молекулярных технологий для диагностики инфекционных заболеваний. Они могут быть использованы для демонстрации того, насколько тесно связаны два вида микроорганизмов, для понимания причин ядовитости отдельных видов, для идентификации новых возбудителей прежде неизвестных заболеваний и для облегчения постановки клинического диагноза. Последнее особенно важно для клиницистов, а потому данная статья будет посвящена главным образом именно этому. Перед тем как привести примеры инфекционных заболеваний кошек и собак, мы сделаем краткий обзор молекулярных технологий. В таблице 1 собраны краткие определения наиболее часто используемых терминов. Затем мы очертим круг проблем, решаемых благодаря применению этих тестов, и, наконец, займемся обсуждением тех из них, которые будут иметь значение для постановки диагноза инфекционных заболеваний в ветеринарии.

Таблица 1. Словарь терминов
16SРНК — фрагмент гена рибосомной РНК.
Ампликон — см. ПЦР-продукт.
к-ДНК — ДНК, скопированная с цепочки РНК, называется комплементарной ДНК.
Комплементарность — единичная цепочка ДНК состоит из аденина (А), гуанина (Г), цитозина (Ц) и тимина (Т) на сахарной и фосфатной основе. Две комплементарные цепочки соединяются вместе благодаря водородной связи между А и Т или Ц и Г.
Цикл — цикл ПЦР-амплификации состоит из денатурации, в процессе которой цепочки ДНК разделяются; присоединения или «отжига» праймеров,в результате которого получается праймер для гибридизации с контрольной ДНК; и достраивания, в результате которого ДНК-полимераза синтезирует новые ДНК, используя в качестве шаблона контрольную цепочку.
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота.
Электрофорез — разделение нуклеиновых кислот в агаровом геле путем пропускания через него электрического тока. По-скольку ДНК обладает отрицательным зарядом, она мигрирует в сторону анода.
Эвбактериальный праймер — ПЦР-праймеры, которые могут амплифицировать (копировать) ДНК различных бактерий благодаря разделенным цепочкам, содержащимся во фрагментах гена 16Sрибосомной РНК.
Гибридизация — процесс смешивания зонда с контрольной ДНК таким образом, чтобы они были способны за счет водородной связи оснований соединяться друг с другом.
Мечение — методика, применяемая для определения наличия зонда.
и-РНК — информационная РНК, содержащая генетический код, необходимый для построения того или иного белка. И-PHK является РНК, скопировавшей необходимый участок гена.
Гнездная ПЦР — второй цикл ПЦР, использующий праймеры, которые все еще комплементарны к контрольной ДНК, но уже частично проникли внутрь первого набора праймеров. Это обстоятельство не только принуждает исходную ДНК к новым этапам амплификации, но и усиливает специфичность ПЦР.
ПЦР — полимеразная цепная реакция, применяемая для амплификации специфических фрагментов контрольной ДНК. Фрагменты, которые должны быть подвергнуты амплификации, располагаются двумя праймерами ПЦР.
ПЦР-праймер — короткий отрезок одноцепочечной ДНК, обычно имеющий длину в 18-25 оснований, который является комплементарным к началу или концу цепочки контрольной ДНК.
ПЦР-продукт — результат ПЦР-амплификации, также известный как ампликон.
Зонд — ДНК различной длины, которая является комплементарной к контрольной ДНК или к ее интересующему в данный момент фрагменту и которая также должна быть меченой.
Рестрикционная эндонуклеаза — один из многочисленных бактериальных ферментов, каждый из которых разрезает ДНК на определенные цепочки.
Реверсионная транскриптаза — фермент, выполняющий копирование ДНК по РНК-шаблону.
Геном — вся генетическая информация организма.
РНК — рибонуклеиновая кислота.
РТ-ПЦР — реверсионная транскриптаза ПЦР. С ее помощью при ПЦР шаблон РНК превращается в его к-ДНК до завершения процесса ПЦР.
Блат-анализ Саузерна — методика, в результате применения которой ДНК разделяется в геле с помощью электрофореза, после чего переносится на нейлоновую мембрану.
Контрольная ДНК — та часть ДНК, которая амплифицируется с помощью ПЦР или определяется с помощью меченого зонда.
Универсальный праймер — праймеры, которые способны амплифицировать ДНК, выделенную у широкого спектра бактерий и вирусов.

 

Специфические молекулярные методы

За недостатком места для основательного введения в молекулярную биологию, автор направляет читателей к обзорам, приводимым в соответствующем разделе (Alleman, 1996; Rosenthal, 1994а, 1994b, 1994с; Rosenthal, 1995). Информация о наиболее важных молекулярных технологиях суммирована в последующих разделах.

Анализ ДНК методом Саузерна
Один из способов проанализировать ДНК микроорганизма носит имя его изобретателя — Е.М. Саузерна. Выделенную ДНК разделяют на небольшие фрагменты с помощью бактериальных ферментов, называемых рестрикционными эндонуклеазами.

Образовавшиеся фрагменты ДНК затем сортируют по фракциям с помощью гелевого электрофореза и переносят (метод называется блоттингом) на нейлоновую мембрану для удобства использования и хранения. При блоттинге Саузерна обычно происходит гибридизация отдельных блотов с меченым зондом, что позволяет идентифицировать ДНК того или иного микроорганизма.

Зонды и гибридизация
Зонд представляет собой фрагмент ДНК, отвечающий двум основным критериям. Он должен быть комплементарен к контрольной ДНК и благодаря этому связываться с ней максимально прочно. Кроме того, он должен быть мечен таким образом, чтобы создавать легко определимый сигнал — например, введением радиоактивного фосфата (32Р). Нерадиоактивные зонды могут быть менее чувствительны, чем радиоактивные, зато они безопаснее. Для нерадиоактивного мечения зонда используется биотин, который способен вызывать изменение цвета при соединении с конъюгатом стрептавидин-щелочной фосфатазы; дигоксигенин, вызывающий цветовую или хемилю-минесцентную реакцию; или флюоресцентный маркер.

Меченые зонды могут использоваться в блотанализе Саузерна, блоты которого изготовлены из геномной ДНК, плазмидной ДНК или ПЦР-продуктов. Мечение зондов является важнейшиим этапом гибридизации insitu.

Гибридизация insitu
Хотя гибридизация зонда на нейлоновой мембране со смесью молекул ДНК, выделенных из клинического образца, может идентифицировать определенный микроорганизм, это не является неопровержимым доказательством того, что именно он является причиной заболевания. При гибридизации insituвместо нейлоновой мембраны в качестве шаблона используется гистологический срез. Сигнал, полученный при использовании меченого зонда, позволяет выявить ДНК или РНК специфического патогена прямо в гистологическом срезе, благодаря чему предварительный диагноз получает свое подтверждение. Эта методика имеет первостепенное значение в иммуногистохимии для диагностики парвовирусного энтерита.

Полимеразная цепная реакция
ПЦР является мощным средством для амплификации точно определенного фрагмента контрольной ДНК. Чтобы быть амплифицированной, контрольная ДНК должна быть специфицирована к двум праймерам ПЦР. Если эти праймеры располагаются на 500 пар оснований дальше от контрольной ДНК, то в результате реакции ПЦР-продукт станет на 500 пар оснований длиннее. Контрольная ДНК подвергается логарифмическому увеличению и удваивается после каждого из 30-40 циклов ПЦР. Уже после 22 циклов количество контрольной ДНК увеличивается в миллион раз. Эти копии контрольной ДНК называются «ампликонами» или «продуктами ПЦР». Каждая реакция должна быть проведена с положительным и отрицательным контролем за ней. Это необходимо для того, чтобы интерпретировать значение любого полученного продукта (см. далее).

Обнаружение продуктов полимервзной цепной реакции
После электрофореза в агаровом геле ДНК способна флюоресцировать в ультрафиолетовом свете в присутствии этидиума бромида. Подтверждение того, что продукт ПЦР уже имеется в достаточном количестве, является важнейшей частью всего процесса, однако этого недостаточно для постановки диагноза. Продукт ПЦР может быть получен от одной из многих других миллионов молекул ДНК, содержащихся в том же самом образце, причем некоторые из них могут быть аналогичны контрольной цепочке, выделенной в праймеры для гибридизации. Иногда это случайное обстоятельство может создать продукт ПЦР того же самого объема, что и контрольный фрагмент. Поэтому для подтверждения происхождения продукта ПЦР обычно используются специальные тесты. Идентичность продукта можно определить с помощью блотанализа Саузерна, использующего меченый зонд к-ДНК. Кроме того, продукты ПЦР можно классифицировать с помощью рестрикционной эндонуклеазы, чтобы создать специфические образцы фрагментов ДНК для каждого из них. Если при использовании одной из этих методик требуемый продукт ПЦР так и не обнаружен, то это обычно означает, что в начальном образце контрольный фрагмент ДНК отсутствовал. Некоторые варианты ныне используемой стандартной ПЦР будут обсуждаться вместе с теми болезнями, при диагностировании которых они применяются.

Диагностика специфических заболеваний

Названия микроорганизмов, амплифицированных с использованием ПЦР и вызывающих инфекционные заболевания у кошек и собак, приведены в таблице 2. Большинство методик ПЦР используется не в клинической практике, а в научных исследованиях, однако ситуация постепенно меняется, и количество ветеринарных лабораторий, использующих молекулярную диагностику, постоянно растет.

Применение ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний можно разделить на четыре категории. Они включают заболевания, которые лучше всего отслеживаются с использованием:

  1. единичного цикла ПЦР,
  2. гнездной ПЦР,
  3. реверсионной транскриптазы ПЦР
  4. универсальных праймеров.

 

Таблица 2. Наиболее общие патогены у кошек и собак, длв диагностики которых существуют методики ПЦР
Микроорганизм Тип
ПЦР
Образец
Toxoplasma 1 СМЖ,внутриглазнаяжидкость,сыворотка,кровь
Neospora 1 Прямо из организма
Haemobartonella ? Кровь
Ehrlichia* 1 Кровяные макрофаги
Rickettsia 1 или 2 Кровь, моча
Bartonella* 1 или 4 Сердечный клапан, кровь
Borrelia 1 или 2 СМЖ, моча, кровь
Mycobacterium 1 СМЖ, лимфатический узел
Yersinia ? Не определяется
Широкий спектр бактерий* 4 Суставная жидкость
ВЛК* 1 Кровь, десны, фиксированные ткани
ВИК 1 или 2 СМЖ, сыворотка, костный мозг
П севдобешенство 1 или 2 Непосредственно из организма
Герпесвирус кошек 1 Конъюнктива, роговица глаза, мазок из глотки, ганглии, глазные нервы
Герпесвирус собак 1 Миндалевидная железа, пояснично-крестцовые ганглии, печень, слюнная железа
Чума собак 3 Кровь, кости
Бешенство 3 или 2 и 3 СМЖ, слюна
Коронавирус кошек 2 и 3 Сыворотка, различные жидкости организма
Парвовирус* 1 Фекалии, фиксированные ткани
ВЛК — вирус лейкемии кошек, ВИК — вирус иммунодефицита кошек, 1 — единичная ПЦР, 2 — гнездная ПЦР,
3 — РТ-ПЦР, 4 — ПЦР с звбактериальными праймерами,
СМЖ — спинномозговая жидкость.
* Ныне используется для клинической диагностики.
* Описана на примере флоридской пантеры.

Амплификация при единичном цикле ПЦР
Наиболее распространенным типом амплификации ПЦР является единичный цикл, который используется в большинстве случае, представленных в таблице 2. Таким путем обнаруживают Toxoplasmagondii, Neosporacaninum, Ehrlichiacanis, Rickettsiarickettsii,виды Bartonella, Borreliaburgdorferi, виды Mycobacterium,вирус лейкемии кошек (ВЛК), вирус иммунодефицита кошек (ВИК) и парвовирусы. Чаще всего ПЦР применяется в ветеринарии для обнаружения вируса герпеса кошек, являющегося причиной язвенного кератита. Этот тест дает большое количество положительных результатов, что затрудняет его интерпретацию.

То же самое, хотя и в меньшей степени, относится к Т. gondiiво внутриглазной жидкости. 19% процентов кошек, страдающих от увеита, дают положительные результаты при использовании ПЦР, однако тот же самый результат дают и 9% здоровых кошек. Даже при использовании надлежащих методов контроля важно понимать, что эти микроорганизмы могут присутствовать, но не являться причиной заболеваний.

В случае вируса лейкемии кошек ПЦР используется для идентификации вирусной ДНК в крови и костном мозге кошек, дававших сероотрицательную реакцию, которые были помещены вместе с кошками, инфицированными ВЛК. При вирусе иммунодефицита кошек диагноз с помощью ПЦР является тем более точным, чем большее количество ферментно-связанных иммуносорбентов испытывается. Ретроспективная ПЦР при исследовании архивных тканей, фиксированных с помощью парафина, выявила ДНК данного вируса в тканях, взятых посмертно у кошек с ВИК-отрицательной реаций, которые умерли от лимфомы. ПЦР для выявления парвовирусов также применяется на фиксированных тканях, однако для более быстрой и эффективной диагностики парвовирусного энтерита следует использовать образцы фекалий.

ПЦР для выявления Е. earnsявляется менее чувствительным методом, чем непрямой флюоресцентный антительный тест или блот Вэстерна, зато он намного быстрее. Поэтому для выявления таких микроорганизмов, которые растут очень медленно (а к ним относится и вид Bartonella),ПЦР имеет несомненное диагностическое преимущество. Единичный цикл ПЦР также может быть использован для обнаружения В. burgdorferi,однако для некоторых образцов — например, спинномозговой жидкости (СМЖ) — чувствительность теста намного выше при использовании метода гнездной ПЦР.

Амплификация ДНК с помощью гнездной ПЦР
Стандартная ПЦР использует 30-40 циклов амплификации. Если контрольный шаблон присутствует в очень низкой концентрации, то этого количества циклов бывает недостаточно. В таких случаях необходимо совершить второй цикл амплификации. Он проводится в новой реакционной пробирке, поскольку первоначальные ферменты к концу первого цикла уже бывают неэффективны. Кроме добавления новых реагентов, второй цикл амплификации может стать более эффективным, если выбрана последовательность праймеров, которая уже слегка проникла в последовательность праймеров, использовавшихся в первом цикле. Подобная методика называется гнездной ПЦР. Ее главный недостаток состоит в том, что два отдельных цикла амплификации отнимают больше времени и создают гораздо больше возможностей для загрязнения ПЦР (эта проблема рассматривается далее, в разделе других проблем молекулярной диагностики).

Гнездная ПЦР часто применяется для обнаружения ДНК В. burgdorferi,но даже столь чувствительный метод может не выявить наличие микроорганизмов в СМЖ, взятой у людей, страдающих нейроборрелиозом. Амплификация образцов, взятых из мочи, дает более надежные результаты, однако следует учитывать то обстоятельство, что в моче у некоторых пациентов, не проявляющих никаких симптомов, содержится Borrellia.В ветеринарной литературе сообщалось о единичном цикле ПЦР для выявления носителей болезни Лайма, однако его клиническая эффективность не изучена, и весьма вероятно, что при его использовании на кошках и собаках возникнут те же проблемы с чувствительностью, как и при диагностировании людей, страдающих от боррелиоза.

Амплификация РНК с помощью реверсионной транскриптазы ПЦР
РТ-ПЦР используется для амплификации образцов РНК, например таких, которые взяты у вируса бешенства собак. Эта РНК в первую очередь должна быть превращена в копию к-ДНК с помощью фермента, названного реверсионной транскриптазой. Данная методика используется главным образом для размножения вирусных РНК — например, вируса чумы собак или инфекционного перитонита кошек (ИПК). ИПК вызывается кишечным коронавирусом, который может провоцировать и общую неклиническую инфекцию. В настоящее время не существует способов провести различие между патогенными и непатогенными штаммами этого вируса. Раньше высказывались предположения, что ПЦР сможет дать надежный тест для выявления ИПК, но они, к сожалению, не оправдались. Первый цикл РТ-ПЦР для выявления кишечного коронавируса кошек часто следует за гнездной реакцией, которая может легко определить наличие микроорганизма. Данная проблема, аналогичная проблеме серологического тестирования, состоит в том, что ПЦР не способна отделить вирус, вызывающий ИПК, от непатогенного кишечного коронавируса. Крайняя чувствительность ПЦР также приводит к тому, что этот метод легко определяет вездесущий коронавирус; таким образом, это очень малоперспективный тест с точки зрения диагностики и прогнозирования. Поэтому результаты ПЦР не могут быть использованы в качестве единственного подтверждения необходимости эвтаназии для кошек, предположительно зараженных ИПК.

РТ-ПЦР также используется для определения того, создает ли микроорганизм и-РНК в качестве шаблона для синтеза новых белков. Этот тест может быть предложен для различения микроорганизма, находящегося в тканях в латентном состоянии, от того, который является источником заболевания.

Амплификация неизвестных микроорганизмов
Праймеры для ПЦР обычно готовятся под определенный вид микроорганизмов. Однако возможен и обратный вариант, когда надо идентифицировать микроорганизм при отсутствии цепочки ДНК. В геноме существуют настолько важные фрагменты рибосомных генов (ген 16Sрибосомной РНК), что их цепочки одинаковы у всех видов бактерий. Между этими тщательно сохраненными фрагментами, содержащими ген 16S, находятся цепочки, которые не столь важны, но от которых зависят различия между родами, а также между видами внутри одного рода. Благодаря так называемым эвбактериальным праймерам, которые являются комплементарными к двум сохраненным фрагментам, ПЦР может амплифицировать те фрагменты, которые не содержат ген 16S, но которые являются специфичными для каждого микроорганизма. Можно взять ранее неизвестный микроорганизм, выращенный на чашке с агаром или прямо на образцах ткани, полученных у зараженного животного, и с помощью эвбактериальных праймеров амплифицировать его, а затем и проанализировать специфичные фрагменты. Эта микробиологическая методика использовалась в ветеринарии, чтобы идентифицировать новые виды Bartonellaв качестве причин эндокардита собак.

Различное виды эвбактериальных праймеров применяются для диагностирования септических артритов, вызванных широким спектром грамположительных и грамотрицательных бактерий. В течение нескольких часов данная ПЦР может определить — содержится ли бактерия или бактериальная ДНК в данном виде жидкости или нет. Поскольку эти праймеры применимы для идентификации большинства видов бактерий, данный тест пользуется большой популярностью и может быть использован в качестве быстрого скринингтеста для выявления бактериемии.

Проблемы, связанные с молекулярной диагностикой

Самая большая проблема полимеразной цепной реакции является прямым результатом ее способности вырабатывать большое количество продуктов (ампликонов). Поскольку ДНК — молекула стабильная, ампликоны могут быстро размножиться и загрязнить все поверхности в лаборатории. После этого они начнут проникать во все проводимые там ПЦР, в результате чего каждая такая реакция окажется положительной, вне зависимости от того, содержал ли образец контрольный микроорганизм или нет. В том, что ситуация именно такова, легко убедиться благодаря реакционным пробиркам, содержащим все необходимое для ПЦР, кроме ДНК. Эти чистые пробирки оставляют открытыми в течение получаса, после чего крышки закрывают и начинаются реакции. В сильно загрязненной лаборатории все реакции дадут положительные результаты, поскольку проникшие в них ампликоны идеальны для дальнейшей амплификации. Данный тип загрязнения представляет проблему лишь в том случае, если все еще используется первоначальная пара праймеров, поскольку ампликоны из одной пары праймеров не являются причиной ложноположительных результатов во всех других праймерах до тех пор, пока не сформировали общую цепочку. Загрязнение ампликонами является проблемой и для гнездных реакций, поскольку между первым и вторым циклом ПЦР пробирка зачастую остается открытой.

Некоторые меры способны уменьшить риск ложно-положительных результатов. Например, саму реакцию следует проводить в одной комнате, а вскрывать пробирку для анализа полученных результатов — в другой (поскольку именно при этом происходит распространение ампликонов). Кроме того, существуют химические методы «стерилизации» ампликонов, что позволяет нейтрализовать их способность становиться целью последующих амплификаций. Хотя бы один из этих методов должен быть указан в каждой диагностической протоколах ПЦР. Но даже после принятия всех этих мер предосторожности важно задействовать соответствующий отрицательный контроль за каждым образцом — вроде реакции с чистыми тубами, описанной выше. Отрицательный контроль, который пренебрегает реверсионной транскриптазой, следует применять и для РТ-ПЦР.

В принципе, даже если риск загрязнения был по возможности исключен, при интерпретации положительных результатов ПЦР существует еще одна проблема. Определенный микроорганизм может действительно присутствовать в клиническом образце, однако находиться там в латентном состоянии, как это бывает с вирусами герпеса (Т.gondii)и некоторыми ретровирусами. Ложноположительные результаты могут возникать и в том случае, если ПЦР используется вместо культуры бактерий, чтобы определить реакцию на антимикробную терапию. Результат ПЦР способен оставаться положительным и после успешно проведенной терапии, поскольку это может амплифицировать микроорганизмы, которые больше не жизнеспособны, но по-прежнему содержат нуклеиновую кислоту.

Ложноотрицательные результаты ПЦР являются меньшей проблемой, однако они порой тоже случаются. Например, когда такой микроорганизм, как В. burgdorferi,все еще присутствует в нервной ткани, однако иммунная система организма способна очистить его от образца СМЖ, используемого в ПЦР. Другой пример ложноотрицательного результата — когда в образце присутствуют ПЦР-ингибиторы, то большинство ингибиторных гемов получены из гемоглобина.

Будущее молекулярной диагностики

Поскольку ПЦР применяется для диагностики все большего числа инфекционных заболеваний, она унаследовала проблемы предшествующих диагностических тестов. К числу этих проблем можно отнести следующие: какой тип образца отбирать, какое количество необходимо и в каком консерванте его хранить, как транспортировать образец и как избежать попадания в него субстанций, способных оказаться ингибиторами. Предстоит ответить и на ряд других, не менее важных вопросов. Поскольку методика ПЦР вызывает ряд технических проблем, то каким образом врач-клиницист может определить — пригодна данная лаборатория для проведения этого теста или нет?

Может ли там осуществляться надлежащий положительный и отрицательный контроль за каждый образцом и как данная лаборатория сообщает о результатах такого контроля? Принимаются ли там необходимые меры предосторожности против загрязнения? Кстати, все эти предосторожности и виды контроля естественно скажутся на стоимости проведения теста. Если лаборатория пытается удешевить стоимость ПЦР за счет экономии на этом, то результаты тестирования не будут иметь никакого значения.

Вдобавок ко всем этим проблемам, необходимо создание соответствующих руководств по интерпретации результатов ПЦР для каждого вида заболеваний, особенно для микроорганизмов, находящихся в латентном состоянии, или для столь распространенных, как коронавирусная кишечная инфекция кошек. Более того, как долго после вакцинации (например, против бешенства собак) ПЦР будет давать положительные результаты? Хотя в ближайшие годы ПЦР приобретет в ветеринарии исключительно большое значение, этот метод приносит с собой столько же вопросов, сколько и ответов.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *